清華新聞網(wǎng)2月10日電 近日，藥學(xué)院尹航教授和張瑩助理研究員團(tuán)隊(duì)首次揭示了核磷蛋白1（Nucleophosmin 1，NPM1）通過(guò)識(shí)別特定RNA基序并誘導(dǎo)相分離，進(jìn)而介導(dǎo)mRNA被選擇性分選進(jìn)入EVs的分子機(jī)制。研究還發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者血清來(lái)源的細(xì)胞外囊泡（EVs）中，NPM1蛋白與表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR） mRNA水平顯著升高，提示該機(jī)制在肺癌進(jìn)展中可能發(fā)揮重要作用。
EVs是細(xì)胞間通訊的重要媒介，能夠攜帶蛋白質(zhì)、脂質(zhì)與核酸等生物活性分子，影響免疫應(yīng)答、發(fā)育調(diào)控及疾病進(jìn)程等多種生理病理過(guò)程。盡管已有研究表明EVs可遞送功能性mRNA至受體細(xì)胞，但mRNA是如何被選擇性裝載入EVs的具體機(jī)制尚不清楚。解析這一機(jī)制對(duì)于理解EVs的生物學(xué)功能及其在疾病治療中的應(yīng)用具有重要意義。
圖1.NPM1被鑒定為EV中mRNA結(jié)合蛋白
研究通過(guò)寡聚dT捕獲技術(shù)與蛋白質(zhì)組學(xué)分析，從海拉（HeLa）細(xì)胞來(lái)源的EVs中鑒定出100多個(gè)與poly(A) RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)其中NPM1的敲低顯著降低EVs中mRNA水平，提示NPM1可能參與mRNA向EVs的裝載過(guò)程。
圖2.NPM1選擇性分選mRNA進(jìn)入EVs
通過(guò)CRISPR-Cas9構(gòu)建NPM1敲除細(xì)胞系，RNA-seq分析顯示NPM1缺失導(dǎo)致EVs中多個(gè)癌癥相關(guān)mRNA（如EGFR、IGF2R、TLK2）水平下降。RNA免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)NPM1與這些mRNA直接結(jié)合。RT-qPCR與流式細(xì)胞分析技術(shù)證實(shí)NPM1可攜帶這些mRNA進(jìn)入到受體細(xì)胞中。
圖3.NSCLC患者血清EVs中NPM1與EGFR mRNA水平正相關(guān)
在18例NSCLC患者與18例健康對(duì)照的血清EVs中，NPM1蛋白與EGFR mRNA水平均顯著升高，且兩者呈正相關(guān)，提示該機(jī)制在肺癌中具有潛在臨床意義。
圖4.鑒定NPM1結(jié)合的RNA基序及其功能驗(yàn)證
通過(guò)生物信息學(xué)分析鑒定出一個(gè)8核苷酸基序“CUGGGAUU”，該基序在EGFR等癌癥相關(guān)mRNA中存在。通過(guò)RNA-pulldown技術(shù)驗(yàn)證NPM1與該基序的特異性結(jié)合能力。利用Cre-LoxP報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證，將該基序連接至Cre mRNA的3’端可顯著增強(qiáng)其通過(guò)EVs遞送至受體細(xì)胞的效率，且該過(guò)程對(duì)NPM1具有依賴(lài)性。
圖5.NPM1與mRNA共定位于晚期內(nèi)體與多囊泡體
蔗糖密度梯度離心與高分辨率顯微成像顯示，NPM1與RNA在細(xì)胞內(nèi)共定位并主要富集于CD63標(biāo)記的多囊泡體中，提示NPM1-mRNA復(fù)合物通過(guò)晚期內(nèi)體-多囊泡體途徑進(jìn)入EVs。
圖6.NPM1與RNA形成相分離凝聚體并招募MVB膜
體外實(shí)驗(yàn)表明，NPM1可通過(guò)其固有無(wú)序區(qū)域與RNA形成動(dòng)態(tài)液相凝聚體。RNA在凝聚體形成的過(guò)程中起促進(jìn)功能?；罴?xì)胞成像進(jìn)一步顯示，NPM1-RNA凝聚體可招募CD63標(biāo)記的多囊泡體膜，促進(jìn)其包裝進(jìn)入EVs。
NPM1的異常功能與多種惡性腫瘤的發(fā)病相關(guān)。本研究系統(tǒng)闡明了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NPM1通過(guò)識(shí)別RNA基序、形成相分離凝聚體并導(dǎo)向多囊泡體途徑，從而介導(dǎo)mRNA選擇性分選進(jìn)入EVs的完整機(jī)制。該發(fā)現(xiàn)不僅深化了對(duì)EVs內(nèi)容物分選機(jī)制的理解，也為基于EVs的RNA遞送與腫瘤治療策略提供了新思路。
研究成果以“NPM1通過(guò)RNA序列識(shí)別與相分離調(diào)控mRNA向細(xì)胞外囊泡的分選”（NPM1 Mediates mRNA Sorting into Extracellular Vesicles via Specific RNA Motif Binding and Phase Separation）為題，于2月3日發(fā)表于《先進(jìn)科學(xué)》（Advanced Science）。
藥學(xué)院2020級(jí)博士生張凱翔為論文第一作者，尹航和張瑩為通訊作者。合作者包括清華大學(xué)生命科學(xué)院魯志副教授、北京大學(xué)第一醫(yī)院胸外科與胃腸外科臨床團(tuán)隊(duì)，研究獲得國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金等資助。
相關(guān)論文鏈接：
https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202514852
供稿：藥學(xué)院
編輯：贠爾茹 邱收
審核：黃思南 周襄楠
